Os testes de detecção de DNA ou RNA de organismos infecciosos (por exemplo, bactérias, vírus) têm impactado enormemente o diagnóstico e o manejo de doenças infecciosas. Isso é particularmente verdadeiro para infecções do sistema nervoso central (SNC), onde a identificação rápida e precisa de um patógeno e o início imediato da terapia antimicrobiana e crucial. A crescente disponibilidade dos testes moleculares para a detecção de microrganismos no líquor (LCR) redefiniu a abordagem para infecções comuns do SNC, como as meningites e as encefalites.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, na sigla em inglês de Polymerase Chain Reaction) é uma técnica molecular amplamente utilizada em biologia molecular, genética e diversas outras áreas da ciência. Desenvolvida na década de 1980 por Kary Mullis, a PCR permite amplificar seletivamente uma pequena quantidade de DNA, tornando possível a análise de sequências específicas de DNA de maneira rápida e eficaz.
A PCR utiliza uma enzima chamada DNA polimerase, que sintetiza novas cadeias de DNA a partir de um modelo de DNA de fita simples, juntamente com primers (pequenos segmentos de DNA que são complementares às sequências de DNA-alvo que se deseja amplificar) e nucleotídeos (as unidades que compõem o DNA). O processo ocorre em ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento, e cada ciclo dobra a quantidade de DNA-alvo.
A PCR é composta por três etapas principais:
- Desnaturação: O DNA-alvo é aquecido a uma temperatura elevada (geralmente cerca de 94-98°C), fazendo com que as duas fitas de DNA se separem, resultando em duas fitas de DNA simples.
- Anelamento (ou hibridização): A temperatura é reduzida para permitir que os primers se liguem especificamente às sequências de DNA-alvo. Os primers são projetados para se unirem às sequências de DNA que se deseja amplificar.
- Extensão: A temperatura é aumentada novamente, e a DNA polimerase sintetiza novas cadeias de DNA complementares às fitas simples do DNA-alvo. À medida que a DNA polimerase adiciona os nucleotídeos às fitas simples, as sequências de DNA-alvo são amplificadas.
Esses três passos são repetidos em um ciclo termociclador, que controla as temperaturas de aquecimento e resfriamento. Cada ciclo praticamente duplica a quantidade de DNA-alvo. Após um número específico de ciclos, a quantidade de DNA amplificado torna-se significativa o suficiente para análises subsequentes, como sequenciamento de DNA, análise de mutações genéticas, estudos de expressão gênica, identificação de patógenos, entre outros.
A PCR revolucionou a biologia molecular e teve um impacto significativo na medicina, na pesquisa científica e em muitas outras áreas, permitindo o estudo e a manipulação de sequências específicas de DNA de forma precisa e eficiente. Existem várias variações da PCR, como PCR em tempo real (qPCR) e PCR quantitativa, que permitem a quantificação precisa de DNA amplificado em tempo real, e a PCR multiplex, que amplifica várias sequências de DNA simultaneamente em um único tubo de reação.
O uso da PCR no diagnóstico das neuroinfecções pode ser realizado a partir de dois tipos de testes:
Testes direcionados – têm como alvo uma única região específica do genoma de um microrganismo específico. Os métodos direcionados são geralmente mais sensíveis do que os métodos convencionais de detecção de antígeno ou cultura, e podem detectar organismos que não são cultiváveis. Em algumas infecções, como a encefalite pelo vírus herpes simplex (HSV) e a leucoencefalopatia multifocal progressiva (LEMP) pelo vírus JC, a sensibilidade clínica é bem conhecida, e foi comparada com o padrão de referência (por exemplo, biópsia cerebral).
Testes multiplex – Os testes de amplificação de ácido nucleico multiplex ou baseados em painéis combinam várias detecções individuais em um único teste, permitindo que os médicos testem uma série de patógenos potenciais que podem causar uma síndrome clínica, ao mesmo tempo. Alguns exemplos são painéis virais, bacterianos, etc. Em 2015, o primeiro teste multiplex comercial para causas infecciosas de meningite e encefalite comunitárias foi liberado pela “Food and Drug Administration (FDA)”, para uso como auxílio no diagnóstico dessas doenças. Este teste multiplex, o Biofire FilmArray, detecta 14 patógenos bacterianos, virais e fúngicos, em pouco mais de uma hora, incluindo: Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus agalactiae (ou seja, Streptococcus do grupo B), Escherichia coli (sorotipo K1), Listeria monocytogenes, enterovirus, vírus herpes simplex (HSV)-1, HSV-2, vírus varicela-zoster (VZV), citomegalovírus (CMV), herpesvírus humano 6 (HHV-6), parecovírus humano e Cryptococcus neoformans / gattii. Uma meta-análise de oito estudos de precisão diagnóstica, avaliando o BioFire FilmArray, demonstrou alta sensibilidade e especificidade (respectivamente, de 90% (IC de 95% 86-93%) e 97% (IC de 95% 94-99%), respectivamente.
O Senne Liquor realiza uma ampla gama de testes de PCR, direcionados e painéis, para o diagnóstico da grande maioria das neuroinfecções:
TABELA: Exames de PCR realizados no Senne Liquor Diagnóstico:
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